電気泳動の新技術

Nov 10, 2023

アンジェロ・デパルマは、ニュージャージー州ニュートンに住むフリーライターです。 [email protected] までご連絡ください。

1980 年代後半に考案された「ラボ オン チップ」というアイデアは、マッチ箱サイズのシリコン、ガラス、プラスチックの板上に分析研究所全体に相当するものを作成しようとしました。 これらのデバイスのほとんどは、マイクロ流体分析デバイスで依然として主流の分析モードであるキャピラリー電気泳動に基づいていました。

マッチ箱サイズの基板上に実験室全体に似たものを製造するという夢は実現しませんでしたが、チップ上で簡単な電気泳動を実行する商用機器が登場しました。 これらは主に、医療診断を含むライフサイエンスに役立ちます。 市場調査レポートでは、このようなシステムの年間成長率は 7% と堅調であると推定されています。

PerkinElmer は、DNA および RNA 用の LabChip® GX Touch™ 核酸アナライザーと、タンパク質およびグリカン用の LabChip® GXII Touch™ タンパク質特性評価システムの 2 つのマイクロ流体電気泳動プラットフォームを提供しています。 どちらのシステムも、電気泳動ベースの生体分子の分離、サイジング、および定量のためのハイスループット プラットフォームを提供します。 パーキンエルマーは、薄いガラスや石英のマイクロチップに低ミクロンサイズのチャネルを埋め込む特別な微細加工方法を開発しました。 マイクロチップはプラスチック製のキャディを介して機器と接続し、簡単なサンプルのロードと機器との係合をサポートします。

「マイクロ流体ベースの生体分子分析とゲルベースの生体分子分析の主な利点は、スループット、分解能、使いやすさ、感度、多用途性です」と、パーキンエルマーのオートメーションおよびマイクロ流体工学のゼネラルマネージャーであるジェームス・アトウッド博士は述べています。 「従来のゲル電気泳動は時間がかかり、労力がかかり、ばらつきが生じやすく、大量の貴重なサンプルを消費します。」

LabChip マイクロ流体ベースのアッセイは、分離ごとにわずか 150 ナノリットルのサンプルを消費し、それぞれ低 pg/μL および ng/mL 濃度範囲の核酸サンプルとタンパク質サンプルに適合します。 LabChip の 1 サイクルあたり最大 384 サンプルのスループットは、ゲルベースのシステムや N 結合型グリカンなどの生体分子のスループットをはるかに上回っています。これらの生体分子は、電気泳動ゲルベースの分離には修正できませんが、マイクロ流体システムで分離および検出できます。 マイクロ流体ベースの生体分子分離のもう 1 つの重要な利点は、電荷のみに基づいてネイティブタンパク質を分離および定量し、電荷変異体を検出できることです。 ゲルベースの電気泳動では、タンパク質の電荷変異を解決できません。

一般的なゲル電気泳動ベースの質量分析ワークフローでは、最初に化合物がゲル内で分離され、次に目的の生体分子に対応するバンドが切除されます。 プロテオミクス ワークフローでは、LC-MS/MS の前にタンパク質が酵素的に分解され、ペプチド フラグメントがゲルから抽出されます。 このアプローチには、直交分離モードであるなど多くの利点がありますが、非常に面倒です。

マイクロ流体チップを HPLC システムおよび質量分析計に直接接続できるようにする、いくつかのマイクロ流体ベースのシステムが開発されています。 これらのマイクロクロマトグラフィー システムでは、マイクロ流体チャネルには、目的の分離モードに特有の固定相が充填されています。 これにより、質量分析計での溶出、イオン化、検出による生体分子の自動捕捉および/または分離がオンチップで直接可能になります。 ゲルベースのアプローチとは対照的に、マイクロクロマトグラフィー システムは自動化に適しており、充填剤の変更に基づいて目的の特定の生体分子を標的にするように調整できます。

Agilent 2100 バイオアナライザー システムで使用されるチップは、試薬とサンプルの適用に使用される 16 個のウェルを備えたプラスチック キャディで構成されています。 各チップには、アッセイの種類、ロット番号、およびアッセイ固有のチップ設定の識別子がラベル付けされています。 ガラスチップにはエッチングされたマイクロチャネルが組み込まれており、キャディの裏側に接着されています。 「ガラスチップと分離チャネルの製造プロセスは、半導体デバイスの製造プロセスと似ています」と、アジレント テクノロジーズ (カリフォルニア州サンタクララ) のバイオアナライザー製品マネージャーのエヴァ グラフ氏は言います。 アジレントは、チャネル構造を反映したタンパク質および核酸チップ用の特別な保護マスクを使用しています。 ガラスチップがエッチング剤にさらされると、チャネルのみがガラスにエッチングされます。 残りのチップ表面はマスクによって保護されます。

マイクロチャネル システムは、キャディのすべてのウェルを注入クロスおよび分離チャネルに接続します。 サンプルを適用する前に、マイクロチャネルは分離ゲルと蛍光色素の混合物で満たされます。 チップの実行中、ガラスチップ内のマイクロチャネルのレイアウトを反映するアッセイ固有のスクリプトに従って、複数のステップで高電圧が印加されます。 「スクリプトは、事前描画、動電学的注入、そしてもちろんサンプルの電気泳動による分離を調整します」と Graf 氏は説明します。 「電気泳動による分離と次のサンプルの事前描画を同時に行うことで、分析時間がサンプルあたり数分に短縮されます。」 分離された分析物は分離チャネル内でレーザー誘起蛍光によって検出され、シグナルはゲル状の画像とエレクトロフェログラムに変換されます。

オンチップ電気泳動では、最小限のサンプル量だけで高分解能の分離が可能となるため、下流でのアプリケーション前の貴重なサンプルの品質管理にとってこの技術は魅力的です。

Agilent にとって、トップの電気泳動チップ アプリケーションには、次世代シーケンス ワークフローにおけるライブラリの品質管理が含まれます。 Graf 氏によると、最適なクラスター密度を達成するには、配列決定前のサイズ分布とサンプル濃度の正確な計算が重要であり、実験出発物質の量と品質を評価することが研究の成功には不可欠です。 「NGS、マイクロアレイ、または qPCR を使用した遺伝子発現解析の出発材料として RNA を使用する場合、実験が失敗する一般的な原因は RNase 分解です。チップベースの RNA アッセイを使用すると、たとえ小さな分解効果や RNA の完全性であっても視覚的に検出することが容易になります。この数値により、サンプルの客観的な認定が可能になります。」

対照的に、従来のゲル電気泳動ではサンプルの完全性の推定のみが可能であり、ユーザー依存の解釈になりがちです。 「DNA アッセイの高感度と広い直線ダイナミック レンジにより、PCR で増幅されたフラグメントや制限酵素で消化されたフラグメントを分析するための最適なツールとなり、ゲノム編集における合成 gRNA の切断効率の容易な評価が可能になります」と Graf 氏は言います。

タンパク質分析の面では、EPC は分析用 SDS-PAGE メソッドに代わる迅速かつ信頼性の高い方法を提供します。 一般的なアプリケーションには、組換えタンパク質の発現、タンパク質精製、安定性研究、または一般的な抗体分析などのプロセス中のタンパク質のサイズ、純度、濃度の評価が含まれます。

ラボの管理者は、話題の要素ではなく、その機能に基づいて機器を評価します。 したがって、チップベースのシステムの購入者は、検討中のシステムが実行を期待する分析の深さと幅を提供していることを確認する必要があります。

グラフ氏は、常にサンプルのスループットを念頭に置き、「特にサンプル濃度、サンプルサイズ、サンプルタイプ（DNA、RNA、タンパク質など）に関してサンプルタイプに適した」アッセイを提供するシステムを推奨しています。 「また、サポート、保証、修理、設置に関するベンダーのサービス、およびシステムの使いやすさも考慮してください。これらはすべて、ラボのダウンタイムを最小限に抑えるのに役立ちます。」

サンプル量は、すべての分析機器の主要なセールスポイントになっています。 容量が少ないほど、消費する試薬とサンプルの量が減り、研究者は希少なサンプルや希少なサンプルを使ってより多くの作業を行うことができます。 たとえば、Agilent の 2100 Bioanalyzer では、RNA および DNA アッセイに必要なサンプルはわずか 1 マイクロリットルです。

製薬研究開発ラボにとって規制遵守は問題であり、電子記録を対象とする適用規制は 21 CFR Part 11 です。 コンプライアンスは、診断ラボや、法医学など、特許や法制度と継続的にやり取りする施設の標準業務にも影響します。

コストは常に考慮すべき事項ですが、研究室が毎日使用する機器の場合、エネルギーと試薬の消費量を考慮した所有コストを考慮する必要があります。 サービス プランは包括的で、一般に迅速な対応が求められる傾向がありますが、非常に忙しいラボでは、ダウンタイムによる経済的影響も考慮する必要があります。